2019年10月（yuè）1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿（niào）病研究领域取得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症是导致2型糖尿病致残致死（sǐ）的重要病因，一直（zhí）缺乏一（yī）种无（wú）创便捷的临床（chuáng）途径实现（xiàn）血管并发症的发生（shēng）发展监测，达到早发现（xiàn）、早（zǎo）干预，以提高T2D病人的整体生活（huó）质量，减（jiǎn）少（shǎo）卫生经济负担（dān）。

该研究入组了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗（yí）传标志物5hmC的（de）分布情况进行检测，分析5hmC标（biāo）志（zhì）物与（yǔ）2型糖（táng）尿病血管并（bìng）发症发生发（fā）展的（de）相关（guān）性。结果表（biǎo）明5hmC标志物（wù）的变化与（yǔ）T2D合并大（dà）血（xuè）管/微血管事件具有相关性，主（zhǔ）要涉及一些与血管生物学和糖尿（niào）病（包括胰（yí）岛素耐受和炎症反应）相关（guān）的基因（yīn）和信号通路。该研究（jiū）建立的（de）16个基因-5hmC标（biāo）志物组合检测可以准确区分有并（bìng）发症和（hé）无并发症的2型糖尿（niào）病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床（chuáng）变（biàn）量例如白蛋（dàn）白尿。除此（cǐ）之外，还建立了13个基因-5hmC标（biāo）志物（wù）组合检测，可以进一步区分T2D合并单一并发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其（qí）他传统（tǒng）临床变（biàn）量（liàng）。该研究（jiū）得出结论（lùn），5hmC标志（zhì）物反（fǎn）映了T2D病人（rén）大（dà）血管/微血管并发症发生（shēng）过程中的表观遗传（chuán）变化，因而5hmC-Seal检测（cè）技术在监测糖尿病（bìng）血管（guǎn）并发症发生和进展方面具有良（liáng）好的（de）临（lín）床应用前（qián）景。

本研究共纳入62例（lì）2型（xíng）糖（táng）尿病病人，包括没有（yǒu）血管并发症的病人12例（lì），有单（dān）一血管并发症的病人34例（24例（lì）发生大血管（guǎn）事件，10例（lì）发生（shēng）微血（xuè）管事（shì）件（jiàn）），以及有多种血管并发（fā）症的病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕（bǔ）获外周血cfDNA中的5hmC序列，进（jìn）行二代测序，通过生物信息学分析找出并发症组与无并发症（zhèng）组之间有显（xiǎn）著5hmC修饰差异的基因，单一并发症组（zǔ）和多种并发症组（zǔ）之间（jiān）有显著（zhe）5hmC修饰（shì）差（chà）异（yì）的基因。随后利用回归模型对差异基因进（jìn）一（yī）步（bù）筛（shāi）选、优化，弹性网络进一步筛选（xuǎn），计算加权（quán）平均分，最（zuì）后（hòu）得到一组具有高（gāo）度灵敏度和特异性的（de）5hmC生物标记（jì）物，并进一（yī）步在实验（yàn）组（zǔ）中验证，分析其灵敏（mǐn）度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基因组合的检测性（xìng）能与传（chuán）统临（lín）床变（biàn）量（liàng）进行（háng）对比分（fèn）析。最后对相关（guān）基因进行了信号通路（lù）分析和功能探究。

5hmC修（xiū）饰水平与血管并发症具有相关性

利用（yòng）逻辑回归模型对（duì）62例有并发（fā）症和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异水平进行分（fèn）析发现，有并发（fā）症（zhèng）2型糖（táng）尿病病人的（de）622个差异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均数要明（míng）显（xiǎn）高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一（yī）并（bìng）发症和多发并发症（zhèng）病人之间没有（yǒu）显（xiǎn）著差（chà）异。

之后将（jiāng）有单一（yī）并发症或多种并发症的50例病人用逻（luó）辑回归模型进行（háng）了对比，发现多种并发（fā）症的病人的153个差异修饰候选基因（包括上调和下调基（jī）因）的归一（yī）化平均数要（yào）低于无并发症病人（rén）（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物可（kě）区分有无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训（xùn）练（liàn）组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网络筛选（xuǎn）后发现，16基因（yīn）-5hmC标志物组合（hé）检测可以（yǐ）用于区分有并（bìng）发症和（hé）无并发症的2型（xíng）糖尿病病人。

基（jī）于16基（jī）因组合模（mó）型 (Detection Model 1) 的加权平均（jun1）分（fèn）分析，发现无并发症病人的分数（shù）在训练集和测试集中都明显（xiǎn）低于有并发症（zhèng）的（de）病人。只考虑加权（quán）平均分的话，受试（shì）者（zhě）工作特征（zhēng）曲（qǔ）线（ROC）分析（xī）表明将cutoff值设置成0.5时（shí），在（zài）测试组中中的灵（líng）敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志物可区（qū）分（fèn）病人是单一并发（fā）症还是多种（zhǒng）并发（fā）症（zhèng）

50例有并发症的2型糖尿病病人被随机（jī）分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用（yòng）弹性（xìng）网络筛选（xuǎn）后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病病人是否发生单一并发症（zhèng）或多（duō）种并（bìng）发症（zhèng）。

基（jī）于13基因（yīn）组合模型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算（suàn）了单一并发症和多种并发症的加权平均（jun1）分（fèn），发现在训练集（jí）和测（cè）试集中单一（yī）并发症和多种（zhǒng）并（bìng）发症（zhèng）病（bìng）人的分数都（dōu）有明显差异（yì）。值得（dé）一（yī）提（tí）的（de）是，有肾病并发症和无肾（shèn）病并发症病人的分数也（yě）有明显差异。利用加（jiā）权平（píng）均分（fèn）作为判断标准的受试者工作（zuò）特征（zhēng）曲线（ROC）表（biǎo）明（míng），在测试组中（zhōng）当将cutoff值（zhí）设成0.69时，灵敏度（dù）为87.5%，特异（yì）性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量/危险因子（zǐ）的（de）对比

我们评（píng）估了（le）不同临床变量/危险因子用于监测血管并发症（zhèng）的（de）灵敏度（dù）和特异（yì）性（见表1）。

信号通路分析和（hé）功能（néng）探究

有（yǒu）并（bìng）发症和无并发（fā）症病人的135个差异（yì）候选（xuǎn）基因的功能（néng）注释分析（xī）表（biǎo）明，这（zhè）些（xiē）基（jī）因主（zhǔ）要富集（jí）在一些经典的信号通路。错误发现率（lǜ）相关P值位于前10%和（hé）基（jī）因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导（dǎo）的信号通路。由（yóu）IGF1R和IL-10介导的（de）信号通路与胰岛素（sù）抵抗及炎症（zhèng）反（fǎn）应相关（guān），在血管生物学和糖尿病发生发展过（guò）程中发挥重要作用。

Reactome相互作用网（wǎng）络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛（fàn）素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基（jī）核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候（hòu）选基因（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个（gè）差异候选（xuǎn）基因中, 一些（xiē）基（jī）因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关（guān）的倾（qīng）向（xiàng），表明5hmC和糖尿病血管并（bìng）发症之间（jiān）可能存在（zài）时间依赖性的相互作用。基（jī）于纵向时间（jiān）队列的大样本研究，将可进一步（bù）明确5hmC变化和糖尿病持续时（shí）间之（zhī）间（jiān）的动态关联（lián）。关（guān）于单一并发症和多（duō）种并（bìng）发症病人的159个候选标志基因的功（gōng）能注（zhù）释研究发现，存在（zài）细胞-细胞（bāo）连接（jiē）、胶（jiāo）原蛋白（bái）形成、新陈代谢（xiè）、细胞应激（jī）应答信号通路的富集，这些信号通路（lù）均与细胞（bāo）基本（běn）功能（néng）密切相关。

血（xuè）管并发症是三分之二（èr）糖（táng）尿病病人的（de）死亡（wáng）原因（yīn），若（ruò）能及早有效控制血管并发症的发生，将极大地改善糖（táng）尿病病人（rén）的生存质量。该研究（jiū）建立（lì）了（le）一种利用（yòng）cfDNA进行2型（xíng）糖尿（niào）病血（xuè）管并（bìng）发症监测的无创（chuàng）便捷方法，较目前（qián）临床（chuáng）标志物（wù）能更准确地监控血（xuè）管并发症的发生（shēng），从（cóng）而提（tí）示临床及早采取应对（duì）措（cuò）施，有效控制病情进展。