2019年（nián）10月1日，5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿（niào）病研究（jiū）领域（yù）取得重要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发症是导（dǎo）致2型糖（táng）尿病致残致死的重要病因，一直缺乏一种无创便捷的临床途径（jìng）实（shí）现血管并发症的发生发展（zhǎn）监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人的整体（tǐ）生活质量，减少卫生经济负担。

该（gāi）研究入组了62例2型糖尿病病人，采（cǎi）用（yòng）5hmC-Seal技术对血（xuè）浆cfDNA中表观遗传标志物5hmC的分布（bù）情况进行检测，分（fèn）析5hmC标志物与2型（xíng）糖尿病血管并发症（zhèng）发生发展的（de）相关性。结果表明5hmC标（biāo）志物的变化（huà）与T2D合并（bìng）大血管/微血管事件具（jù）有相关性，主要涉及（jí）一些与血（xuè）管生物学和糖尿病（包括（kuò）胰岛素耐受和炎症反应）相关（guān）的（de）基（jī）因和信（xìn）号通路。该研究建（jiàn）立（lì）的16个基因-5hmC标志物（wù）组合检测可（kě）以准（zhǔn）确区分有并（bìng）发症和无并发（fā）症的2型糖尿（niào）病病人（rén）[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统（tǒng）临床变量例如白蛋白尿。除此之外，还建立了13个基因-5hmC标志物组合检测（cè），可（kě）以进（jìn）一步（bù）区分T2D合并单一并发症和多种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他（tā）传（chuán）统临床（chuáng）变（biàn）量。该研究得出结论，5hmC标志物反映了T2D病人大（dà）血管/微血管（guǎn）并发症发生过程中的表观遗传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技（jì）术在监测糖尿病血管并发症发（fā）生和进展（zhǎn）方面具有良好的临床应用（yòng）前景（jǐng）。

本研究共纳入62例2型糖尿病病人，包括（kuò）没有（yǒu）血管并发症的病（bìng）人（rén）12例，有单一血管并发症的病（bìng）人（rén）34例（lì）（24例发生（shēng）大血管事件，10例发生微血管（guǎn）事件），以及有多（duō）种血管并（bìng）发症的病人16例（lì）。试验收集62例病人（rén）血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周（zhōu）血cfDNA中（zhōng）的（de）5hmC序列，进行二（èr）代测序（xù），通过生（shēng）物信息学（xué）分（fèn）析找出并（bìng）发症组（zǔ）与无并发症（zhèng）组之间（jiān）有显（xiǎn）著5hmC修饰差异的基因，单一并（bìng）发症（zhèng）组和多（duō）种并发症组之间有显著5hmC修饰（shì）差（chà）异（yì）的基因。随后利用回归模型对差异基因进（jìn）一步筛选、优化，弹性网络进一步筛选，计算加权平均分，最后得到一组（zǔ）具有高（gāo）度灵敏度和特异性的5hmC生物标记物，并进一步在实验组中验证，分析其灵敏度（dù）和特异性。并将新（xīn）建（jiàn）立的5hmC标志物基因组（zǔ）合的检测性能与传统临床变量进行对比分（fèn）析。最后对（duì）相（xiàng）关基（jī）因进行了信号通路分析和功能探究。

5hmC修饰水（shuǐ）平（píng）与血管并发症（zhèng）具有相关性

利用逻（luó）辑回归模型对62例有（yǒu）并（bìng）发（fā）症和无并发症（zhèng）2型糖尿病（bìng）病人（rén）的5hmC差异水平进行分析发（fā）现，有并（bìng）发症2型糖尿病病（bìng）人的（de）622个差（chà）异修饰候选基（jī）因（包括（kuò）上调和下（xià）调基因）的归一化平均数要明显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发症病人之（zhī）间（jiān）没有（yǒu）显著差异。

之后（hòu）将有单一并发（fā）症或多种并（bìng）发症的50例病人用逻（luó）辑回归模（mó）型进行了对比，发现多种并发症（zhèng）的病（bìng）人的153个差异修饰候选（xuǎn）基因（包括上调和（hé）下调基（jī）因）的归（guī）一化平均数要低于无并发症（zhèng）病人（rén）（P<0.001）。

5hmC标（biāo）志（zhì）物可（kě）区（qū）分有无并（bìng）发（fā）症患（huàn）者

62例2型糖尿病病人被随机分（fèn）成训（xùn）练组（n=31）和测（cè）试组（n=31）。利（lì）用弹（dàn）性网络（luò）筛（shāi）选（xuǎn）后（hòu）发现，16基因-5hmC标志物组合检测可（kě）以用于区分有并（bìng）发症和无并发（fā）症的2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发（fā）现（xiàn）无并发症（zhèng）病人（rén）的（de）分数（shù）在训练集和测试集中（zhōng）都明显低于有并发症的病人。只考虑加权平均分的话，受试（shì）者工（gōng）作（zuò）特征曲线（xiàn）（ROC）分析（xī）表明将cutoff值设置成0.5时（shí），在（zài）测试组中中的灵敏度为60%，特（tè）异性为100%。

5hmC标志物可（kě）区分病（bìng）人是单一并发症还是多种并发症

50例（lì）有并发症（zhèng）的2型糖尿病病人被随机（jī）分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用（yòng）弹性（xìng）网络筛（shāi）选后发（fā）现，13基（jī）因-5hmC标志物组合可（kě）以区分（fèn）2型糖尿病病人是否发生单一（yī）并发症或多（duō）种并（bìng）发症。

基于13基因组合模型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多（duō）种并发症（zhèng）的（de）加（jiā）权平均分，发现在训练（liàn）集和测试集中单一并（bìng）发症和多种并发症（zhèng）病（bìng）人（rén）的分数都有明显差异（yì）。值（zhí）得一提（tí）的是（shì），有（yǒu）肾病并发症和无肾病并发症病人的分（fèn）数也（yě）有明显差异。利（lì）用加权平均（jun1）分作为判（pàn）断标（biāo）准的受试（shì）者工（gōng）作特征曲线（ROC）表明，在测（cè）试组中（zhōng）当将cutoff值（zhí）设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异（yì）性为68.8%。

5hmC标志物与传统临（lín）床变（biàn）量/危险因子的对比

我们评估了不同临（lín）床变（biàn）量/危（wēi）险因（yīn）子用（yòng）于监测血管并发症的灵敏度和特异性（xìng）（见表1）。

信（xìn）号通路分析（xī）和功能探究

有并（bìng）发症和无并发症病（bìng）人的135个差异（yì）候选基因（yīn）的功能（néng）注释分析表明，这些基因主要富集在一些经典（diǎn）的信号（hào）通（tōng）路。错误发现率（lǜ）相（xiàng）关（guān）P值位于前10%和基因数目≥3的信（xìn）号通路（lù）包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介（jiè）导（dǎo）的信号通路。由IGF1R和（hé）IL-10介导（dǎo）的（de）信号通路与胰岛素抵抗及（jí）炎症反应相关，在（zài）血管生物学（xué）和糖尿病（bìng）发生发展过程中发挥（huī）重（chóng）要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基（jī）核（hé）糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者。在这135个差异（yì）候选基因中, 一些基因（yīn） （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程（chéng）相关的倾向，表明5hmC和糖（táng）尿病血管并发症之间可（kě）能存在时间依赖性的相互（hù）作（zuò）用。基于纵向时间队（duì）列的大样本研究（jiū），将可进一步明确5hmC变化（huà）和糖尿（niào）病持续时间之间的（de）动态关联。关于单一并发症和多种并发症病（bìng）人的159个候选（xuǎn）标志基因（yīn）的（de）功能注释研（yán）究发现，存（cún）在细胞-细胞（bāo）连接（jiē）、胶原蛋（dàn）白形成、新陈代谢（xiè）、细胞应激应答信号（hào）通路的富集，这些信（xìn）号通路均与细胞基（jī）本功能密切相关。

血管（guǎn）并发症是三分（fèn）之二糖尿病病人的死亡原（yuán）因（yīn），若（ruò）能及（jí）早有效（xiào）控制血管并发（fā）症的发（fā）生，将极大地改善（shàn）糖尿病（bìng）病人（rén）的生存质（zhì）量。该研究建（jiàn）立了（le）一种利用cfDNA进行2型糖尿病（bìng）血管并发症监测的无创便捷方法（fǎ），较（jiào）目前临床标志物能更准确地监控血管并发症的发（fā）生，从（cóng）而提（tí）示（shì）临床及早采（cǎi）取（qǔ）应对措施，有效控制病情进展（zhǎn）。